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实验室建设与采购

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【专题】想不想做一个聪明的实验室偷懒达人？

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楼主 丁香通
丁香通

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这个帖子发布于6年零344天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
实验室里经常听到这样的抱怨：实验没做好，实验没结果，心情郁闷。但其实静下心来查找原因，往往是由于操作上面的不认真，或是一些小小的细节没有注意到。丁香通实验站每期推出战友提供的10个实验室日常小技巧。凡跟帖提供偷懒高招的战友，内容审核过关后，可获赠丁当1个。

跟帖格式
主题：关于质粒提取的小技巧
内容：现在用质粒提取试剂盒非常方便，而且菌体培养后，可以多管浓缩提取，提到的质粒量多，可以-20℃保存，以后用于酶切、转化等实验，可以提前跑个胶，只要不降解，就可以继续用，避免每次要用，都要培养一遍再提取一遍。

1、质粒DNA提取
提取质粒的时候，最后一步的酒精挥发很关键，基本上是其后续的酶切反应的决定性因素。所以这一步尽量挥发长一点时间，最好是空调吹热风，或是37度温箱放长一点的时间，我试过室温过夜，酶切很好。

将amp浓度提高到200ug/ml，下班前接种，次日一早收获菌体，此时OD虽然不高，质粒丰度却不一般。菌体量少些，操作体积（管数）也小（少）。

手提质粒，如果用氛氯仿和氯仿两步抽提，再注意一下手法，严格按照参考书上面的操作的话，提出的质粒不比任何质粒提取试剂盒差，我感觉好像还好一点，我就用过一次试剂盒，比较了之后不如我手提的好，以后再也没用过了。

2、 Western Blot
做western blot的时候，大家往往会摸索一抗、二抗的浓度，封闭时间，曝光时间等等，而每次变换其中的一个条件就需要从新跑胶、转膜，甚至重新提蛋白，这样会浪费大量的时间。其实完全没有必要这样。一次转膜后，将PVDF膜晾干，裁减成小块，保存起来，用的时候取出一块，没有任何影响。这对于摸索条件的战友来说，节约了大量的时间。
做western blot 转膜时，胶放在转膜缓冲液中一段时间，待胶在含有甲醇的缓冲夜中缩小的差不多后装 好转膜装置，我的经验是把膜印在胶上直接在膜上画出预染maker条带，方便的很。因为很多时候跑电泳时胶上的预染maker很清楚，等转膜后就不是分辨的很清楚了。不过要注意画好预染maker后就不要使胶和膜发生对位移动了，以防maker失去参照价值。

器具的清洁非常重要，开始做前，为了安全，尤其是装胶的厚薄玻璃板，可以先用中性洗涤剂和自来水反复冲洗，确保无洗涤残液后用蒸馏水冲洗2－3遍，然后用去离子水冲洗一遍。最后用95％酒精再擦一遍后晾干备用。
配胶最好现用现配，先配下层胶（分离胶），后配上层胶（浓缩胶或积层胶），而且在临灌胶前加APS并迅速混匀，即用移液*抽吸与注入1－2次即可。

3、 缓冲液和培养基配置
（1）将缓冲液配方中的成分分别以10-100倍配成母液储存，需要的时候只需将相应的母液混合，补加水稀释即可；
（2）配培养基时通常会忘记各成分的量，如配LB时的三个成分不记得到底哪个是5 g，哪个要10个，因此可以在常用的试剂瓶的标签上注明所需的量，如配LB时，在NaCl瓶外注明10 g/L， yeast 5 g/L， tryton 10 g/L等，很方便，不需要每次配之前临时翻书。

4、 PCR
在做克隆鉴定的时候经常需要在酶切鉴定前进行PCR鉴定，每次配置PCR反应液很繁琐，可以将其配置类似kit的形式，按你需要的反应体系列表，然后放大100倍配置100×主反应液（100次反应），其中含buffer，Mg2＋，dNTPs，但不含引物和Taq酶，然后可以10×分装或一管储存在－20度，在需要的时候拿出融开，然后按所需的PCR反应个数吸取相应的倍数，再补加相应反应倍数的Taq和引物，混匀后分装，这样做的好处如下：
（1）可极大的节省宝贵的时间，可早点收工，看球；
（2）避免每次反应加样不均的可能；
（3）大大减少PCR假阳性的产生。

5、 酶切
如果是要做酶切，提质粒的最后一步最好是用水溶解DNA，因为TE里面的离子会影响酶切的效率。
双酶切制备克隆插入片段的载体，最好选择带有外源片段的质粒，是否酶切完全，从电泳条带的分子量上可以比较明确地判断。空质粒单切完全和双切完全在分子量上差异不大。
在做酶切时，也可以象PCR一样配置主反应液，每次反应前先列好反应的体系，算好需要的反应数，然后按所需反应的体系按所需反应数放大，加入buffer、酶、水，质粒栏空缺，然后混合后按除质粒DNA的体积分装，然后再在每管中加入相应体积的质粒DNA酶切，这样做的好处如下，特别是当同时有10几个阳性克隆需要鉴定时尤为明显：
（1）各反应成分均一；
（2）可大大减少限制型内切酶的使用；
（3）节省时间。

6、 大肠杆菌转化实验
有时候第一天涂的转化平板、次日早晨转化子可能长成的菌落比较大（1~2毫米以上，BL21就长得快），下一步转化子做质粒鉴定。这个情况下可以直接挑取一块菌苔（勿带出培养基），50微升酚/氯仿悬浮菌体，放置两分钟，加40微升TE抽提，上层TE吸出后再氯仿抽提一次，吸取上层TE即是质粒提取液。提取的质粒可以直接用于电泳和酶切。这样操作，可以省去转接液体试管的培养步骤，至少节省6~8小时的时间。但是，要在各步骤都控制得很好的情况下才能保证提取和酶切的效果，不同的实验室或者操作者未必能够很方便地重复。

转化时一定要做一个宿主菌的对照，即重组质粒涂板后再用宿主菌涂响应抗性的平板，以确定第二天长出来的克隆是否正确，我当时做了三次转化之后才发现不成功竟然是由于BL21可以在Amp（+）的平板上面生长。

7、 蛋白质的表达、分离、纯化
当蛋白大量的表达时，包含体的形成几乎是不可避免的，而且很难通过改变一些诱导条件来改变，最有效的办法就是换表达系统，所以如果时间还充分的话，可以尝试一下，如果时间较短了，还是安心的座包含体蛋白的处理算了，而且变性之后的蛋白通过一些方法复性率也可以达到60％以上。

8、 PCR扩增产物的克隆
引物设计主要是要注意以下几个事项：
（1）发夹结构；
（2）反向配对；
（3）GC含量（40－60%）；
（4）退火温度（45－65度）；
（5）引物长度（18－27bp）；
（6）3' 端最好是C、G（提高结合度）；
（7）引物在序列中的错配位点。
大致就这几个方面，重要性依次降低，由其是3' 端绝对不能形成发夹结构。
那么你说你这段能不能设计引物呢？其实设计引物都只是好中选优的问题。

9、 细胞冻存和复苏实验
（1）可以提前把需要的体积的培养液放到培养瓶里，拧松瓶盖，放到孵箱里半小时到1小时，这样温度和ph值都已经最适合细胞生长了。
（2）为防止冻存管在升温时爆裂等，可以在放入水浴前就实现在超净台里把盖子拧松一下然后再拧上。从液氮罐里拿出来不是说一定要分秒必争地放入水浴。细胞从液氮的零下1百多度升到比如负八十这个过程对细胞没有损害。有足够的时间handle这些。只不过一旦细胞化了，就应该争分夺秒地把它放入培养液了，主要是为了稀释DMSO。常温下高浓度DMSO对细胞的损害比较大。
（3）水浴温度40℃应该也没问题，但正规的protocol上从来都只说37℃。反正应该相差不大，但不能太高了。另外，不必等细胞全化了再从水浴里取出来。只要冰块浮起来了就差不多了。我一般最多水浴不超过1.5分钟。然后经过喷酒精消毒什么的差不多又半分钟过去了。每次都还有没化的。先把已经融解的部分吸到培养瓶里，再从培养瓶里吸些培养液到冻存管里，余下的冰块瞬间就化了，再一起吸到培养瓶里。

10、 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）
（1）RT-PCR有两种做法
条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。（promega）。
（2）RT-PCR应具备的条件
高质量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。
（3）RACE
我做过RACE（3’RACE是宝生物的Kit；5‘RACE是Gibico），但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE的方法），而另一个基因的3’UTR却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的3‘UTR太长的缘故。
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2013-02-20 11:55 浏览 : 74334 回复 : 205
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丁香通 编辑于 2013-02-20 14:00
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viviank
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主题：关于PCR的小技巧
内容：很多人每次PCR只设计一对引物，这样经过PCR、转化、验证，差不多要一个多月了，如果结果不对，又要重新设计。我每次都是一次性设计3对，引物设计也不是太贵。一起P，那个出来的条带最好就选哪个，可以节省很多时间。
2013-02-20 14:52
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（3）水浴温度40℃应该也没问题，但正规的protocol上从来都只说37℃。反正应该相差不大，但不能太高了。另外，不必等细胞全化了再从水浴里取出来。只要冰块浮起来了就差不多了。我一般最多水浴不超过1.5分钟。然后经过喷酒精消毒什么的差不多又半分钟过去了。每次都还有没化的。先把已经融解的部分吸到培养瓶里，再从培养瓶里吸些培养液到冻存管里，余下的冰块瞬间就化了，再一起吸到培养瓶里。

直接冰，水，都倒进培养瓶里不就OK了，还来回折腾干啥？
2013-02-21 16:07
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