jay86527
本人近来从小鼠肝脏和脾脏中提取蛋白做WB，在提取过程中遇到一些问题想分享出来，盼高手能解答：
1，每个组织我都称量30mg-40mg，然后加1ml的RIPA裂解液，在2ml玻璃匀浆器中匀浆，保持在冰上，但是在匀浆的时候出现很多粘稠样的东西。随后又加1ml裂解液，以为是浓度高了，加完在匀浆还是有些许粘稠的东西还在，离心也离不下去，一直都在上清中，最后我就把粘稠样的东西丢弃后取上清。不知道这个粘稠的东西是什么，有人说是DNA，有没有高手能告诉我怎么提取组织蛋白比较好，
2，上清我分装冻-20°C后，拿出解冻的时候，发现在所有上清中有不溶物，也不是粘稠的，再次离心取上清，请问这是不是蛋白没溶解好，
3，用上述提取的蛋白我又做了个beta-actin，发现条带有拖尾，
4,蛋白我用BCA测蛋白后，再上样，发现beta-actin不一致，有些测出来的值不高，反倒是beta-actin显出来后条带比测出来值高的还亮。是不是BCA不准确。
5，我还看到一个蛋白定量的方法：
电泳估算法： 样品倍比稀释，SDS-PAGE电泳，同时做定量marker对照，可以估算样品大概浓度。
以提取癌组织总蛋白为例：
①取等量胰腺癌组织、癌旁组织及正常胰腺组织，用dH2O漂洗5～10次，再用预冷的1×PBS洗涤3次，目的是去除样本中的血液。
②每2克组织加入3ml 1×PBS匀浆，保持在4℃条件进行。
③加入5×STOP Buffer缓冲液1ml，混匀，4℃下超声碎化。再加入0.5ml β-ME，0.5ml溴酚蓝，煮沸10mins，至此，制样过程完成；
④SDS-PAGE电泳，以BAS作为对照估计样品蛋白浓度。
以上不明白的是定量marker是什么。以BAS做定量，是对比条带的灰度值来定量？
盼高手能解答我心中疑惑，不胜感激~~