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铁杆站友

106楼

请问该贴内容是否为原创稿件？如果是你们实验室的工作，是否已经发表？
PCR扩增物污染实验室是PCR操作过程中最难清除的一种污染
由于工作中的失误,常可引起扩增物破损,导致整个实验室污染,这种PCR扩增物污染实验室是最难清除的一种污染,其拉增的DNA可漂浮在室验室的各个角落,形成气溶胶现象,如果下次还在污染后的实验室进行标本检测常可引起假阳性结果.为清除这些污染,本人对其进行了DNA污染物消毒法的对比研究,现将结果提供给大家,以便同道碰上相同问题时可针对污染情况选择消毒方法.
清除PCR扩增产物污染的方法探讨
聚合酶链反应（PCR）具有操作简便、灵敏度高和特异性强等优点。但也常因标本受PCR扩增产物污染而产生假阳性结果。因此，控制外源性DNA污染已成为各实验室非常关注的问题。近年来，人们采用了许多方法消毒处理不同的污染环境和污染物[1-5]，但结果报导不一。为选择一种消除实验室DNA污染的最佳方法，我们选用六种传统的消毒法进行对比研究。现将结果报告如下。
一、材料和方法
1. 仪器和试剂 Roche lightcycler 荧光PCR检测仪（德国罗氏公司）；乙肝病毒核酸扩增PCR荧光检测试剂盒（深圳匹基生物工程股份有限公司）；石英紫外线杀菌灯(30W，1米处辐射强度为105μW／cm2，江苏启东市荧光灯厂)；XMG－1•2脉动真空蒸汽灭菌器（连云港千婴医疗设备有限公司）；84消毒液（南京江南消毒剂厂）；过氧乙酸（江苏双氧水厂）；戊二醛消毒剂（Merck）；次氯酸钠（上海试剂一厂综合经营公司）；甘氨酸和硫代硫酸钠（中国医药上海化学试剂公司）。
2. 方法：(1) 乙肝病毒核酸扩增PCR荧光检测：按试剂盒说明书要求进行，取经各种消毒方法处理后备用的PCR阳性扩增产物（HBV-DNA扩增产物）直接加入核酸扩增试剂内，用PCR检测仪检测DNA考贝数。(2) 中和剂的选择：84消毒液、过氧乙酸和次氯酸钠用2.0%硫代硫酸钠；戊二醛用1.0％的甘氨酸。(3) 紫外线消毒法：取PCR阳性扩增产物，分别用生理盐水和双蒸馏水将其稀释成1×107/ml，加入96孔细胞培养板，每孔0.1ml，每样本各10孔；分别取5孔置4℃冰箱自然干燥。将这些标本同时置于紫外线灯下照射30、60、120 min后用亚沸蒸馏水恢复原体积备用。（4）压力蒸汽消毒法：将浓度为1×107/ml 的PCR阳性扩增产物置试管中，放入高压灭菌器内进行123℃ 20min和135℃ 10min加热消毒后备用。（5）4种化学消毒剂对标本的处理：取4支塑料尖底离心管，加入浓度为1×107/ml的PCR阳性扩增产物，每支20μl；然后分别加入经1∶20稀释的84消毒液、1：100稀释的过氧乙酸消毒液、含氯量为2000mg/L的次氯酸钠溶液和2％戊二醛消毒液各80微升；在20℃环境下，标本在84消毒液和过氧乙酸消毒液中作用2h、戊二醛和次氯酸钠消毒剂中作用30min，立即加入相应的中和剂中和后备用。（6）对照试验：PCR扩增产物经4种化学消毒剂作用相应时间和加入中和剂后，再分别加入PCR扩增产物至2×106／ml，混匀后及时进行PCR测定。
二、结果
1. 经紫外线照射后PCR扩增产物含量变化见表1。4种标本随着紫外线照射时间的延长，PCR扩增产物的清除率明显增加。在相等的照射时间，用生理盐水稀释干燥后的标本，PCR扩增产物下降率显著低于其他组。
表1 紫外线消毒前后PCR扩增产物含量变化
标本  例数  照射前
(copies/ml）  照射时间（min）
      30  60  120
蒸馏水稀释扩增产物  5  1×107  5.4×106  2.1×105**  1.3×102*
生理盐水稀释扩增产物  5  1×107  4.3×106  1.9×105**  1.5×102*
蒸馏水稀释后干燥的扩增产物  5  1×107  1.7×105**  1.1×102*  0*
生理盐水稀释后干燥的扩增产物  5  1×107  9.1×106  7.0×106  7.0×106
注：**与相同照射时间的生理盐水稀释后干燥的扩增产物结果比较，P＜0.05；*与相同照射时间的生理盐水稀释后干燥的扩增产物结果比较，P＜0.01.

2． 5种消毒法对PCR扩增产物的影响：压力蒸汽消毒135℃ 10 min和84消毒液能完全清除PCR扩增产物中的DNA；戊二醛消毒液、过氧乙酸消毒液、次氯酸钠消毒液和压力蒸汽消毒123℃ 20 min可以减低DNA含量，结果见表2。

表2 PCR扩增产物消毒前后DNA含量变化
消毒方法  消毒时间  消毒前
(copies/ml)  消毒后
(copies/ml)  对照试验
(copies/ml)  DNA减少倍数
压力蒸汽消毒  123℃、20 min  1×107  3.3×105  －  30.3
压力蒸汽消毒  135℃、10 min  1×107  0  －  1×107
84消毒液  2 h  2×106  0  1.1×106  2×106
过氧乙酸消毒液  2 h  2×106  7.3×104  2.7×106  27.4
戊二醛消毒液  30 min  2×106  1.6×104  1.1×105  125.0
次氯酸钠消毒液  30 min  2×106  1.7×105  6.0×105  11.8
三、讨论
临床常用的化学消毒剂有含氯消毒剂、过氧化物类消毒剂和醛类消毒剂等，这些消毒剂对灭活病毒均具有明显的作用 [4, 5]。紫外线照射方便易行，消毒面广，对仪器设备影响较小而被广泛应用于各实验室消毒[1,2]；紫外线可使DNA中的胸腺嘧啶和RNA中尿嘧啶转变成胸腺嘧啶二聚体或尿嘧啶二聚体，导致核酸的灭活。压力蒸汽消毒能通过脱嘌呤和变性灭活DNA和RNA，是常规微生物灭活的最佳方法，即使高浓度的HBV-DNA在112℃,15min可以部分灭活，30min完全灭活[3]。
本实验结果提示，根据各实验器材的不同要求，应首选紫外线照射、84消毒液和压力蒸汽消毒(135℃ 10 min)作为清除实验室外源性DNA污染的方法；过氧乙酸消毒液、次氯酸钠溶液和戊二醛消毒液不可作为常规清除实验室PCR扩增产物污染消毒剂。另外，紫外线照射虽能有效地清除由PCR扩增产物污染造成的实验室环境污染，但当消毒物中附有晶体或其它有机物时效果较差，因此在具体操作时应予以考虑。

2008-07-14 20:50

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biowind 编辑于 2008-07-16 15:55

• 急诊抢救药品输液泵配制方法详解（一）！

qinxin1981_

小儿内科

铁杆站友

+1 积分
107楼

大家发了那么多的应该注意的危险因素,我来谈点实验室事故的处理吧:
1. 创伤：伤处不能用手抚摸，也不能用水洗涤。若是玻璃创伤，应先把碎玻璃从伤处挑出。轻伤可涂以紫药水(或红汞、碘酒)，必要时撤些消炎粉或敷些消炎膏，用绷带包扎。
2. 烫伤：不要用冷水洗涤伤处。伤处皮肤未破时，可涂擦饱和碳酸氢钠溶液或用碳酸氢钠粉调成糊状敷于伤处，也可抹獾油或烫伤膏；如果伤处皮肤己破，可涂些紫药水或1％高锰酸钾溶液。
3. 受酸腐蚀致伤：先用大量水冲洗，再用饱和碳酸氢钠溶液(或稀氨水、肥皂水)洗，最后再用水冲洗。如果酸液溅入眼内，用大量水冲洗后，送校医院诊治。
4. 受碱腐蚀致伤：先用大量水冲洗，再用2％醋酸溶液或饱和硼酸溶液洗，最后再用水冲洗。如果碱溅入眼中，用硼酸溶液洗。
5. 受溴腐蚀致伤：用苯或甘油洗濯伤口，再用水洗。
6. 被磷灼伤：用1％硝酸银，5％硫酸铜或浓高锰酸钾溶液洗濯伤口，然后包扎。
7. 吸入刺激性或有毒气体：吸入氯气、氯化氢气体时，可吸入少量酒精和乙醚的混合蒸气使之解毒。吸入硫化氢或一氧化碳气体而感不适时，应立即到室外呼吸新鲜空气。但应注意氯气、溴中毒不可进行人工呼吸，一氧化碳中毒不可施用兴奋剂。
8. 毒物入口：将5—10m1稀硫酸铜溶液加入一杯温水中，内服后，用手指伸入咽喉部，促使呕吐，吐出毒物，然后立即送医院。
9. 触电：首先切断电源，然后在必要时进行人工呼吸。
10. 起火：起火后，要立即一面灭火，一面防止火势蔓延(如采取切断电源，移走易燃药品等措施)。灭火的方法要针对起因选用合适的方法。一殷的小火可用湿布、石棉布火砂子覆盖燃烧物，即可灭火。火势大时可用泡沫灭火器。但电器设备所引起的火灾，只能使用二氧化碳或四氯化碳灭火器灭火，不能使用泡沫灭火器，以免触电。实验人员衣服着火时，切勿惊慌乱跑，赶快脱下衣服，或用石棉布覆盖着火处。
11. 伤势较重者，应立即送医院。

2008-07-14 21:01

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qinxin1981_ 编辑于 2008-07-14 21:19

• 院外心脏骤停15次，台上再停3次，好在活了过来

7天

丁香园准中级站友

+3 积分
108楼

[标题] 实验记录一定要做好收好

[实验室心情手记]
无论做什么试验，肯定都要做试验记录。我从小就讨厌记课堂笔记，为此吃过不少苦头。即使这样我现在也没喜欢上记实验记录。我最容易犯的错就是随手乱写乱记（相信很多人都有这种不良习惯）。我每次试验前都会准备试验记录本，但不是忘记拿，就是依然随手找张纸就记录，心里想着做好试验后，在把记录写在记录本上。等做好实验及记录完实验数据后，接下来的事就是清理试验战场，我经常干的事就是把这张记有数据，弄得象垃圾一样的纸和垃圾一起丢掉。害得自己经常在发现需要数据时，再跑到垃圾桶里翻出来。有次我在翻找垃圾桶时被总监看到，我随口就说闻到垃圾桶有味道，我怀疑有生物危害的垃圾丢在普通垃圾里面了。结果领导当时就重视了，让人直接把垃圾桶拿走当生物危害垃圾给处理了。我当时的心情就象是中了大奖，接着又被告知领奖期限过了，白欢喜一场。这个试验白做了，因为这批实验的数据没了。搞笑的是领导居然表扬了我，说我工作认真负责，关心公司发展等类的话，真是让我“幸福”了好几天。其实最让我头昏的事情，就是我写记录的字迹比较潦草，经常是自己写的记录，过不了一段时间，因实验需要我再查询相关记录时，经常需要辨认自己写的是什么，因为字迹潦草（记得所里有个同事因7与2写的很像，结果导致某新药的药理试验剂量错误，十几万打了水瓢。害得她以后的工作不但没奖金，还为实验室工作了2年，惨痛的教训）。而且我的记录本里还经常会夹带有一些记录数据不能割舍的纸张。每次都想好好整理记录本，但每次都往后面拖。搞笑的是我经常会把记录本放的自己都找不到，或者下班后忘记锁在抽屉里，为此被“相关人士”警告过好几次，钱也被罚过不止一次，真是教训啊！经过不懈的努力，我已经改了很多，但偶尔还会再犯个错，也许是处罚的不厉害。

做细胞实验，我们对穿戴要求比较严格，或着说有些麻烦，我在试验期间就经常把细胞的相关信息写在手套上（相信很多人也有这种习惯），实验期间手套经常要喷酒精消毒，可一喷酒精，手套上记录的信息就模糊不清了，而且手套表面还弄的一塌糊涂。那个郁闷就别提了，真想打自己一巴掌，可下次一样不长记性。因为乱丢乱放的习惯还有几次污染过细胞（污染了别人的细胞，呵呵），弄得我现在只给做动物实验了。

[点评]
完整的试验记录不仅可以很好的反映试验情况，而且对以后的相关试验有一定的参考和指导作用，所以试验记录一定要真实、完整、详细的记录好，千万不能马虎、偷懒。试验期间可只记录试验数据或一些要点，最好记录在专用记录本里。实验后一定要认真整理试验数据，详细的记录实验过程等，无论实验成败都要记录，特别是细节对以后会有帮助，如有需要还可加上备注说明，和一些自己的分析等等。记录本的书写字迹一定要工整，潦草的字迹会让以后的辨认困难，由此也可能引起一些错误。实验后记录本一定要放在安全，且自己可以随时找到的地方。

[安全小贴士]
1、试验记录是一定要记的，不可不记或少记。试验时一定要带好试验记录本，需要记录的地方一定要认真对待，不能偷懒省事，更不能随便的把实验数据记录在零散的纸张上。如果试验忙可先记录实验要点，和必须的数据等等，实验后认真总结，并完善好实验记录。
2、试验记录的书写一定要内容尽可能的详细认真，字迹要工整。特别是数据的书写要规范，不能写出四不像的数字。不然麻烦事就会来找你。如果单位允许，可试验时有个记录本，只记录实验数据和实验要点。实验后的整理和分析等再用一个新的记录本记录。这样即使有一本丢失，还会有一个备份在，另外最好再做一个电子版的备份记录，只是工作量会增加。
3、记录好的试验记录本一定要认真检查核对。要把记录好的实验记录本放置好，千万不能随便的乱丢乱放。特别是重要、机密的实验记录。

2008-07-16 10:04

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• 盆腔肿物，少见病例，病理出来了，请你诊断

tanzhen613

铁杆站友

+2 积分
109楼

[标题] 又一个高速冷冻离心机的故事
[实验室心情手记] 近来一直在纯化包涵体，却总是没有纯化出来。每天都在离心机室呆上好几个小时，都有些厌烦了，因为我们要求离心机运行过程中也要始终有人在旁监视的。前两天早上来了之后，一切都按照要求操作的，配平也做了。但是离心时，在提速的过程中，突然显示不平衡，而且听见机子发出很大的摩擦声，但是响了一下就没有那么大的杂音了。我听见声音就立刻按了Stop。不过现在想来应该按Faststop键的。以前因为一直没有人说过，自己操作也从来没出现过这样的问题，所以可能因为此导致了磨损吧。因为在减速的过程中发出了很大的声音。之后自己检查了一下，2个离心管不平了。一个配平管大概差了1g左右，仔细一看，原来是管口有漏液。可能是之前灭菌处理后有形变导致的。结果转轴目测还没什么问题。但是轴底部的塑料基座一样的部分还有白色塑料突出的位置给刮掉了。本以为暑假会很快修好，结果Beckman那边说大概要1个月左右才能有人来看看。耽误了自己，也耽误了别人的试验。郁闷啊。。。
[点评]离心管也很重要，尽量使用原装的吧。
[安全小贴士]
离心管也要检查检查
[危害的补救措施]
机子坏了只能修了。。千万不要带伤上阵啊，呵呵。。。

2008-07-21 13:35

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• 上海市2021年2月CPC病例讨论（已揭秘）

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